细胞冻存是一种重要的生物医疗技术，通过在低温条件下保存细胞，以确保其活性和功能得以长期维持。这一方法在细胞系的长期保存、实验的重复性、基因库的建立及细胞治疗的储备等方面具有重要意义。细胞冻存可以有效减少因传代过程中的遗传变异以及污染、环境变化或实验操作失误所导致的细胞损失。最佳的冻存时机是在细胞处于最佳生长速度时。

在细胞冻存过程中，冷冻保护剂是关键成分。常用的保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油，主要功能是降低溶液的冰点，减少冰晶形成，从而有效保护细胞免受机械损伤。DMSO适用于大多数细胞类型，但有些细胞对其敏感，此时可选择甘油作为替代。

第一阶段：冷冻保存实验步骤

1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型以及其他相关信息（如基因改造）。

2. 对于贴壁细胞，首先去除培养基，用PBS清洗，添加适量的胰蛋白酶覆盖细胞，并在37°C培养箱中孵育约2分钟（具体孵育时间取决于细胞类型）。随后，加入等量的培养基终止消化，使用移液枪轻轻吹打细胞，将贴壁细胞冲洗下来，转移到50mL Falcon管中。

3. 对于悬浮培养的细胞，直接将所需体积的细胞转移至50mL Falcon管中。

4. 使用血细胞计数器计数细胞以确认活力，冻存细胞的活力应至少为75%。

5. 在室温下以300×g离心5分钟。

6. 按照表1准备冷冻培养基。

表1：不同哺乳动物细胞系适用的冻存培养基配方

细胞类型：在含有FBS的培养基中培养的细胞；冻存培养基配方：90%胎牛血清 + 10%二甲基亚砜。

细胞类型：在无血清培养基中培养的细胞；冻存培养基配方：90%条件培养基 + 10%二甲基亚砜。

细胞类型：需要甘油冷冻的细胞；冻存培养基配方：90%胎牛血清 + 10%甘油。

使用前应将冷冻培养基混合均匀并加热至37°C，确保其包含有效的冷冻保护剂。

7. 除去上清液。

8. 根据所需细胞密度加入冻存培养基，通常对于哺乳动物细胞，该浓度为1×10⁶/mL冻存液。细胞在冻存液中室温下放置的时间不应超过10分钟。

9. 将1mL样品分装到冷冻管中并盖紧盖子。

10. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，然后放入-80°C的冰箱。冷冻盒外周应添加适量的异丙醇，确保温度以每分钟1°C的速度稳定下降。缓慢的冷冻过程有助于防止细胞内冰晶的形成。

11. 约24小时后，从冷冻盒中取出冷冻管并转移到液氮中以便长期储存。冷冻的细胞一般可在液氮中保存数年，但不宜在-80°C下保存过久，最佳如能尽快转移至液氮，以免损害细胞活力。

第二阶段：解冻冷冻细胞系实验步骤

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，立即放入37°C水浴中，直至约80%解冻（避免在室温下解冻），此过程应控制在1分钟以内。

2. 使用移液器将冷冻管中的细胞转移至含约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。

3. 以300×g离心5分钟，弃去上清液，并用适量培养基重悬细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移至培养容器，并放入37°C培养箱中继续培养。

使用尊龙凯时的冷冻保存技术，能够更有效地维护细胞活性和功能，为生物医疗研究提供保障。