RNA模板的制备

常见的RNA提取方法

在生物医药领域，RNA模板的制备至关重要。常用的RNA提取方法包括传统的酚-CHCl₃抽提法和柱式抽提法。以下将详细介绍这两种方法的操作流程。

酚-CHCl₃抽提法

以尊龙凯时产品RNAisolater Total RNA Extraction Reagent (Vazyme#R401)为例，需要准备的材料包括CHCl₃、异丙醇、75%乙醇（DEPC水配制）及DEPC水。

在样本制备时，应注意样本量过大可能导致裂解不完全，进而影响最终产物的纯度。1ml的RNAisolater最多可处理的样本量如下：

贴壁细胞的处理

1. 丢弃培养液，并用PBS洗涤一次。
2. 每10cm²的培养面积添加1-3ml RNAisolater，确保覆盖细胞表面，然后用移液器轻轻吹打细胞。
3. 将裂解液转移至15ml离心管中，并用移液器反复吹打直到无明显颗粒存在。冰上静置5分钟。

悬浮细胞的处理

1. 将细胞离心收集，并用PBS洗涤一次。
2. 每5×10⁶-10⁷个细胞加入1ml RNAisolater。
3. 用移液器反复吹打至无明显颗粒，冰上静置5分钟。

动物组织的处理

采用液氮研磨法以获得高质量RNA：
1. 将液氮研磨得到的组织粉末立即转移至离心管中，并加入RNAisolater裂解液。待样本完全融化后，再进行吹打至裂解液清澈透明。
2. 转移裂解液至离心管，12,000×g，4℃离心5分钟，吸取上清。

匀浆处理

1. 可将新鲜组织剪碎后浸泡在RNAisolater裂解液中，并使用电动匀浆器高效匀浆。
2. 将裂解液转移至离心管，12,000×g，4℃离心5分钟，吸取上清。

柱式抽提法

以尊龙凯时的FastPureTM Cell/Tissue Total RNA Isolation Mini Kit (Vazyme#RC101/RC111)为例，准备的材料包括β-巯基乙醇、无水乙醇及RNase-free枪头等。

对于贴壁细胞，可以直接使用Buffer RL1（预先加入β-巯基乙醇）进行消化和裂解，或用胰酶消化后离心再加入Buffer RL1，每2-5×10⁶个细胞添加500μl的Buffer RL1，反复吹打混匀至无细胞团块。

悬浮细胞则直接离心并加入Buffer RL1（已加入β-巯基乙醇），每2-5×10⁶个细胞纳入500μl的Buffer RL1，混匀后可存放于-70℃以待后续操作。

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